近期，清华大学、郑州大学联合德雷塞尔大学在国际生物制造学领域最具影响力期刊之一的《International Society for Biofabrication (ISBF) 》发表题为《Coacervation-triggered hierarchically assembled hydrogels with application as surgical sealant》的研究成果。
该研究开发了一种凝聚作用触发的成型方法，使重组人胶原蛋白（RHC）和单宁酸（TA）能够进行分层组装，该方法制备的水凝胶具有作为手术密封材料的多种优良性能，包括快速凝胶时间(<10s)、凝血时间(<60s)、超拉伸性(应变>10000%)、强粘附力(粘附强度>250 kPa)。最后成功应用于心脏和肝脏组织的牢固粘附和密封之用。这项工作为生物医学应用提供了一种在潮湿和动态生物环境中极具前景的水凝胶基外科密封剂。
该实验研究中采用的重组胶原蛋白（以下简称RHC）由江苏江山聚源生物技术有限公司研发生产，由杨洋博士提供给本研究项目组。
研究背景
粘附性水凝胶作为组织粘合剂、外科密封剂和止血材料具有巨大的应用潜力。然而，开发能够在潮湿、动态的生物组织上快速可控发挥粘附作用的水凝胶材料是一个巨大的挑战。因此，研发一种能改善水凝胶的湿粘附和即时止血性能，以及可塑、可成形和自愈合能力的水凝胶至关重要。
研究成果
在这项研究中，模拟了天然材料的凝聚过程和分层组装结构，通过引入RHC和TA分子，首次开发了一种非常有前途的水凝胶基手术密封胶。通过调节二者凝聚过程的参数，RHC和TA组装体的构象从颗粒状聚集体演变为网状聚集体（松散）和网状聚集体（致密），伴随着机械和粘附性能的显著增强。由此得到的分层结构水凝胶显示出了几个关键特征，满足潜在的手术密封胶的要求：(1)易于加工和操作，(2)快速的凝胶和止血能力，(3)强大的机械和坚韧的粘附性能，(4)超拉伸和自愈合能力，(5)良好的生物相容性。由于上述特性，水凝胶成功地应用于原位切口部位，并迅速凝聚，以在潮湿和动态的生物环境中实现强大的粘附。此外，RHC和TA本身都具有良好的生物相容性，且不需要额外的引发剂或交联剂。
本研究提出了一种很有前景的手术密封胶，可广泛应用于手术体内生物组织的粘胶，为水凝胶结构设计提供了科学和应用依据，以促进高性能生物材料的先进制造。
实验路线及结果
图1 基于RHC和TA制备快速交联、高粘附、超拉伸和止血水凝胶的设计策略。(a)分子建模中RHC和TA的代表性结构。(b)基于RHC和TA之间物理相互作用的大分子组装到层次塑造的示意图。(c)水凝胶作为手术密封胶的不同特征。
图2 基于分子动力学模拟的RHC与TA之间的潜在相互作用。(a)从分子建模中获得的RHC和TA的代表性结构及其相应的表面显示结果。(b)RHC与TA相互作用过程中空间构象变化的分子动力学模拟。(c)TA分子与RHC蛋白氨基酸之间氢键相互作用的模拟模型。黄色的虚线：氢键。(d)RHC和TA的结合能随模拟时间的变化。透琼斯势(LJ势）、静电势能（库仑势）。(e)RHC和TA之间的质心距离作为模拟时间的函数。(f)RHC的均方根偏差（RMSD）作为模拟时间的函数。
图3 不同成分的RHC与TA之间的凝聚相互作用。(a)不同组成的水凝胶前驱体的光学图像、(b) SEM图像、(c)紫外-可见光谱、(d) FTIR光谱。
图4 RHC-TA水凝胶的合成与表征。(a)RHC溶液（20% w/v）、TA溶液（40% w/v）及其混合物的光学图像变成了略黄色的水凝胶。(b)在RHC和TA之间不同浓度下的水凝胶形成示意图。(c)不同的水凝胶形成阶段，从液体、颗粒状聚集物到网状聚集物。(d)不同水凝胶形成阶段的光学和荧光图像。比例尺：400µm。
图5 (a)不同成分的RHC-TA水凝胶的振荡频率扫描(G\：存储模量\\损耗模量(b)是RHC-TA水凝胶的可塑性、可塑性和自愈合特性。
图6 RHC-TA水凝胶的力学表征。(a)照片显示了RHC-TA水凝胶的超拉伸性。直径分别为500、300和150µm的直丝的(b)扫描电镜图像。用RHC-TA水凝胶制作的不同螺旋形细丝的扫描电镜图像。比例尺：400µm。(c)描述RHC-TA水凝胶的交联和超拉伸机理的示意图。(d)拉伸应力-应变曲线和(e)不同RHC浓度从5%、10%、15%到20%（w/v）的水凝胶的压缩应力-应变曲线）（TA浓度：40% w/v)的曲线。
图7 RHC-TA水凝胶的粘附性和凝血性能。(a)贻贝产生由大量可伸缩的囊线组成的粘附囊。囊状线的光学和荧光图像。(b)图像显示了RHC-TA水凝胶的原位合成过程和表征。(c)图像显示了RHC-TA水凝胶对自然组织的粘附行为。(d)使用猪皮肤组织表面进行的搭接剪切试验示意图。(e)不同RHC浓度为5%、10%、15%到20%（w/v）的RHC-TA水凝胶的代表性粘附应力置换曲线（TA浓度：40% w/v）。(f)水凝胶的粘合剂强度。(g)用RHC（20% w/v）和不同TA浓度（5%、10%、20%、40% w/v）产生的RHC-TA水凝胶进行凝血形成随时间的平板测定。(h)用不同TA浓度的RHC（20% w/v）产生的RHC-TA水凝胶的定量凝血时间(**p < 0.01).
图8 Ta介导的粘聚和粘附相互作用的反应化学示意图。内聚过程是由分子间的相互作用驱动的，特别是RHC和TA之间的氢键。粘附过程得益于TA与亲核试剂的强结合亲和力。组织表面的酰胺、胺和硫醇)。
图9 RHC-TA水凝胶在动态、水下环境下的粘附性能。(a)RHC-TA水凝胶用于小鼠组织的水下粘附展览，包括心脏、肝脏、肺、肌肉、骨骼和皮肤。(b)扫描电镜图像显示RHC-TA水凝胶与组织之间的粘附界面。
图10。RHC-TA水凝胶的生物相容性。(a)成纤维细胞（MRC-5细胞）在RHC-TA水凝胶上培养1、3和7d后的活/死染色的荧光图像。比例尺：300µm。在水凝胶上培养7d的(b) F-actin/DAPI染色图像。比例尺：300µm。(c)在RHC-TA水凝胶上培养1、3和7d后，定量测定细胞活力。(d)不同天数细胞增殖比较(**p < 0.01).
图11。将粘合剂RHC-TA水凝胶作为手术密封胶在大鼠心脏出血模型中的体内评价。(a)在大鼠心脏出血模型中，RHC-TA水凝胶的止血能力示意图。(b)立即原位形成RHC-TA水凝胶治疗心脏损伤的大体图。箭头和圆圈分别表示出血部位和经水凝胶处理的部位。(c)移植后7天，RHC-TA水凝胶附着在心脏组织表面的苏木精/伊红染色图像。比例尺：1200µm。(d)对RHC-TA水凝胶与心脏组织表面之间的粘附区域的放大视图。比例尺：300µm。(e)RHC-TA水凝胶在大鼠心脏组织表面的粘附强度。(f) RHC-TA水凝胶显著提高了介入治疗后的生存率。(g)移植后7天对RHC-TA水凝胶的免疫染色分析。比例尺：300µm。切片用CD3或CD68抗原染色，用DAPI反染。红色代表免疫细胞，蓝色代表细胞核（DAPI）。
研究意义
本研究通过联合应用RHC和TA，开发能够在潮湿、动态的生物组织上快速可控发挥粘附作用的水凝胶材料，显著提高了机械性能和粘附性能。
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